激光共聚焦顯微鏡工作原理

　　激光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，把光學(xué)成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+ 、PH值，膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強有力的研究工具。激光共聚焦成像系統(tǒng)能夠用于觀察各種染色、非染色和熒光標記的組織和細胞等，觀察研究組織切片，細胞活體的生長發(fā)育特征，研究測定細胞內(nèi)物質(zhì)運輸和能量轉(zhuǎn)換。能夠進行活體細胞中離子和PH值變化研究(RATIO)，神經(jīng)遞質(zhì)研究，微分干涉及熒光的斷層掃描，多重熒光的斷層掃描及重疊，熒光光譜分析熒光各項指標定量分析熒光樣品的時間延遲掃描及動態(tài)構(gòu)件組織與細胞的三維動態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)件，熒光共振能量的轉(zhuǎn)移的分析，熒光原位雜交研究(FISH)，細胞骨架研究，基因定位研究，原位實時PCR產(chǎn)物分析，熒光漂白恢復(fù)研究(FRAP)，胞間通訊研究，蛋白質(zhì)間研究，膜電位與膜流動性等研究，完成圖像分析和三維重建等分析。
 

　　基本原理
 

　　傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點光源對標本內(nèi)焦平面的每一點掃描，標本上的被照射點，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光點倍增管(PMT)或冷電耦器件(cCCD)逐點或逐線接收，迅速在計算機監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點。