光譜檢測(cè)-如何設(shè)定特定探針發(fā)射光的光譜檢測(cè)范圍

為了拆分多色成像的發(fā)射光譜，首先由分束器或色散元件將不同顏色的光引入到不同的方向[1]，帶通濾片則能夠最大限度地減少串色，并抑制所有殘留的激發(fā)光，最終到達(dá)傳感器。在過去，常使用的濾片是普通的玻璃帶通濾片。如今，一項(xiàng)革命性的設(shè)計(jì)誕生了，那就是在多波段組件（探測(cè)器）中使用光度計(jì)滑塊。該設(shè)計(jì)可以極為有效地探測(cè)發(fā)射光，同時(shí)提供*可調(diào)諧性，與此同時(shí)帶來的好處是使光譜掃描成為了可能。使用白激光作為光源時(shí)，可調(diào)諧光譜檢測(cè)器是與可調(diào)諧光源光譜自由度匹配的設(shè)備。其他的光譜檢測(cè)設(shè)備使用一系列檢測(cè)元件，其波段是固定的，但它們不可調(diào)諧，靈敏度較低。

 
玻濾光片
在以前，熒光顯微鏡總是使用玻璃濾光片作為屏障濾光片。極早期的熒光顯微鏡是透射系統(tǒng)，即它們?cè)谕干涔庀逻M(jìn)行操作。后來該技術(shù)*被反射光束路徑（落射光）取代，入射光系統(tǒng)可以更好的進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射分離。由于熒光強(qiáng)度僅為照明的約10-4到10-10倍[2]，所以這是一個(gè)至關(guān)重要的要求。屏障濾光片必須完成兩個(gè)任務(wù)：首先，盡量阻擋雜散光（由于樣品或光學(xué)組件中的反射，殘留激發(fā)光到達(dá)探測(cè)光路）。其次，如果樣品含有多種熒光物質(zhì)（減少串色），屏障濾光片可以進(jìn)一步縮小收集的光譜帶寬以增強(qiáng)通道信號(hào)的特異性。
玻璃濾光片可能由有色玻璃材料制成，有多種不同顏色。然而，有色玻璃的性能取決于其使用的化合物，除了混合各種化學(xué)品來接近所需的透射性質(zhì)外，沒有其他方法來設(shè)計(jì)光譜特性。在設(shè)計(jì)上更靈活的濾光片基于多層涂層（沉積在透明玻璃上）。這種涂層或多或少為設(shè)計(jì)可見光譜內(nèi)的任何帶通提供了選擇?？梢杂酶鼜?fù)雜的涂層作為多通濾片，具有三個(gè)或四個(gè)透射波段，中間有反射部分，允許多重激發(fā)和檢測(cè)。
盡管多層涂層技術(shù)非常先進(jìn)，但此類設(shè)備的局限性在于其不可調(diào)性。為了用于多種染料之間的組合，系統(tǒng)必須配備一組此類濾光片，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，這些濾片必須通過手動(dòng)或電動(dòng)操作插入光路。這使得基于濾片的系統(tǒng)的靈活性變差，實(shí)驗(yàn)效率低下。
 
圖1：基于有色玻璃或干涉涂層的經(jīng)典帶通濾片。要更改探測(cè)光譜區(qū)間，必須更換濾片。這需要許多濾光片和電動(dòng)交換裝置(©–.)。
多波段分光光度計(jì)：探測(cè)器
還有一種*不同的方法可以從整個(gè)光譜中選擇所需波段，即使用與光譜重疊的機(jī)械設(shè)備。如果一束光穿過色散元件（棱鏡或光柵），色散后的光會(huì)根據(jù)其能量在空間上擴(kuò)散，光子的能量與顏色相對(duì)應(yīng)。舉一個(gè)簡(jiǎn)單的例子，將色散后的光投影到白色表面上，即可觀察到生成的光譜。長(zhǎng)期以來，人們用相紙來記錄和定量。而現(xiàn)在，人們用數(shù)碼相機(jī)芯片來查看和分析光譜分光鏡）。
除此以外，也可以通過在白色表面的位置插入機(jī)械狹縫，并測(cè)量透射能量來從整個(gè)光譜中選擇一個(gè)窄帶。狹縫的位置可以在光譜上移動(dòng)，然后測(cè)量能量分布作為位置的函（光譜儀）。
不同顏色的發(fā)射光對(duì)應(yīng)的能量也不同。為了檢測(cè)樣本發(fā)射光的全部能量，需要打開狹縫并將其居中，檢測(cè)窗口就會(huì)覆蓋發(fā)射光譜，并屏蔽光譜的其他部分。這種器件是一種帶通濾波器，它的優(yōu)點(diǎn)是中心頻率和帶寬都可調(diào)諧——它包括任何（單）帶通濾波器的可能。此類器件與適當(dāng)?shù)膫鞲衅鳎ɑ颍┙Y(jié)合使用，就成為了共聚焦顯微鏡通用、靈敏的檢測(cè)器。
如前所述，頻帶光譜儀只能用于單通道實(shí)驗(yàn)。然而，生物醫(yī)學(xué)研究中的現(xiàn)代熒光實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)通道。通過串聯(lián)機(jī)械狹縫裝置可以巧妙地解決這個(gè)問題[3]。在這種多波段探測(cè)系統(tǒng)（后稱為“探測(cè)器"）中，機(jī)械狹縫元件類似于高反射鏡。第一個(gè)通道所需的波段通過狹縫后，光譜的其余部分被引導(dǎo)到后續(xù)的探測(cè)器（幾乎無損失），到達(dá)這些探測(cè)器之前再次被反射鏡滑塊進(jìn)行選擇。理論上，可以無限串聯(lián)這種波段探測(cè)器。由于現(xiàn)實(shí)原因，目前的設(shè)備最多備5個(gè)傳感器。
該設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是效率高（狹縫透過率100%，反射鏡反射率99%），所有波段的獨(dú)立自由光譜都可以進(jìn)行調(diào)諧。當(dāng)用白激光（可調(diào)諧光源）進(jìn)行照明時(shí)，探測(cè)器是一個(gè)能合理地整合激發(fā)的高度靈活的裝置。此外，每個(gè)通道都配有專用的傳感器，可以進(jìn)行獨(dú)立的電子放大和基線設(shè)置。

圖2：探測(cè)器采用玻璃棱鏡，具有高透射率和分光性能。通過可移動(dòng)的反射鏡滑塊將光譜分成多個(gè)波段。這使得光譜可以分成任何可能的子光譜集，然后被檢測(cè)器通道測(cè)。。
 
其他方法
繼檢測(cè)器后，其他的一些設(shè)計(jì)相繼問世，旨在配合多波段方法的優(yōu)勢(shì)。其中之一陣列檢測(cè)器，通常是多陽極光電倍增管，將光譜投射到其上[4,5]。雖然這些設(shè)備可以更簡(jiǎn)單地放大檢測(cè)信號(hào)，但它們有明顯的缺點(diǎn)：由于必須對(duì)不同部分進(jìn)行機(jī)械分離，使用多陽極陣列會(huì)使得收集的光子減少。它們受到光電串?dāng)_的影響，無法單獨(dú)調(diào)整放大功率。這些波段本質(zhì)上是固定的，即不可調(diào)諧，因此無法適用于當(dāng)今使用的熒光染料的各種發(fā)射特性——未來發(fā)射特性會(huì)越來越復(fù)雜。這些設(shè)備不輸出分配給單個(gè)發(fā)射種類的信號(hào)，而只是輸出光譜的固定部分。因此，它們必須要通過分解算法對(duì)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行后處理，以獲得有意義的通道數(shù)據(jù)。（使用探測(cè)器，將信號(hào)分配給不同發(fā)射種類，此時(shí)分離可以清除殘留重疊。）
陣列探測(cè)器還強(qiáng)制要求發(fā)射光具備線性色散。因此無法在配備了陣列探測(cè)器的系統(tǒng)中使用棱鏡，所以只能使用光柵，但其性能具有重大缺陷。第一，光柵輸出不均一，衍射的最大值位于閃耀波長(zhǎng)處。因此，在較長(zhǎng)和較短波長(zhǎng)下收集的數(shù)據(jù)低于真實(shí)值。第二，光柵對(duì)偏振的依賴性很強(qiáng)，對(duì)非偏振光（這是生物熒光發(fā)射的典型情況）的衍射效率會(huì)降低到50-70%左右（針對(duì)表現(xiàn)好的顏色）。因此需要使用其他光學(xué)元件彌補(bǔ)該缺陷[6]。光柵的第三個(gè)問題是：輸入能量不僅在單一光譜中釋放，而且還釋放進(jìn)入了0階和更高階的散射光中去。這降低了所有光柵的整體衍射效率。同樣也引入了其他更多的光學(xué)設(shè)備來解決這個(gè)問題[7]。
這些設(shè)備都是基于記錄光譜的理念而設(shè)計(jì)的。然而，除非在非常罕見的情況下，熒光成像不需要記錄光譜。熒光成像需要重新計(jì)算低效獲得的光譜以提供有意義的染料信息。探測(cè)器不會(huì)受到高階損耗的影響，也不會(huì)受到偏振相關(guān)的影響。它提供*可調(diào)的檢測(cè)帶，并具有單獨(dú)的放大功能。它可以進(jìn)行線性分解處理，這是一個(gè)額外的優(yōu)勢(shì)—意味著同時(shí)也可以在高分辨率下記錄光譜[8]。因此將可調(diào)白激光與可調(diào)檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行組合是非合理的。
 
圖3：?jiǎn)吸c(diǎn)探測(cè)器（探測(cè)器）可以調(diào)整樣品中各種染料發(fā)射的動(dòng)態(tài)差異。與多陽極陣列探測(cè)器相反，兩個(gè)探測(cè)窗口都是可調(diào)的，并且可以單獨(dú)調(diào)整動(dòng)態(tài)范圍。