相分離與顯微成像的特點

相分離/相變

（Phase separation，Phase Transition）

相分離/相變是近幾年生化、細胞生物學新興且十分火熱的研究領域。Hyman和Brangwynne 2009年在Science發(fā)表了題為：Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation 的文章，提出了細胞內通過“相分離"，可以提供一種特定的方式讓細胞內的特定分子聚集起來，從而在“混亂的"細胞內部形成一定“秩序"，為困擾了大家多年的問題，提供了全新的思路。
 

分離或相變（Phase separation，Phase transition）描述的是細胞里不同成分間相互碰撞、融合形成液滴，從而使一些成分被包裹在液滴內、一些成分被阻隔在液滴外的現(xiàn)象，就如同水油相混，細胞里的不同成分也會相互分離，形成液滴，這就是相分離。后續(xù)的大量研究也讓生物學家發(fā)現(xiàn)相分離在細胞生物學中無處不在。2011年，Hyman, Mitchison 和 Brangwynne又發(fā)現(xiàn)核仁有液滴現(xiàn)象，后續(xù)研究相繼發(fā)現(xiàn)RNA和蛋白質分子間存在較弱的作用力，形成液滴類的物質、蛋白質-蛋白質存在相分離現(xiàn)象；至2018年CNS上已發(fā)表十幾篇重要級文章證實相分離的廣泛存在和重要性。
 

圖1. 細胞內的油滴藝術 
 

細胞內的相分離

細胞中存在各種無膜結構的細胞器：顆粒、核仁、Cajal bodies、stress granules、miRISC及突觸的細胞骨架等，相分離廣泛發(fā)生于各種成分之間。
 

蛋白質或RNA分子

蛋白質或RNA分子間的物理作用力可以使它們相互分開或聚集。一旦分子達到一定濃度，它們就會發(fā)生相分離，相似的成分聚集在一起加速生物學反應（類似于相似相容），或者隔離無關的分子。
 

細胞膜上的信號傳遞

在神經細胞中，細胞間進行信號傳遞時，蛋白質在連接處的聚集和相分離是保證細胞間信號傳遞正常進行所必需的。
 

DNA折疊包裝

在細胞核中，相分離幫助壓縮折疊不使用的DNA并抑制其活性。一些可能與轉錄相關的蛋白被阻隔在外。
 

液滴成為障礙 

在肌萎性脊髓側索硬化癥中，分離成液滴的蛋白質會逐漸凝結、變硬，形成有害的固體物質。

圖2. 細胞內的相分離

相分離的主要應用

隨著相分離的研究逐漸增多，研究人員發(fā)現(xiàn)相分離在無膜器官的形成、信號轉導、細胞骨架、超分子組裝、基因激活等方面起著重要作用，相分離異常可能導致如神經退行性疾病、腫瘤、衰老等。
 

神經退行性疾病

在肌萎側索硬化（ALS） （一種運動神經元疾?。?中觀察到“相分離"，發(fā)現(xiàn)FUS蛋白和hnRNPA1在ALS中形成液滴，液滴粘性逐漸變強，最終形成纖維狀的固體，在ALS中異常沉積。
 

阿爾茨海默病患者腦內異常沉積的tau蛋白也存在相分離，相分離可能是tau蛋白聚集的初始觸發(fā)因素。

圖3. FUS蛋白相分離作用圖解；FUS蛋白相分離熒光圖像
 

腫瘤

分子病理學家Miguel Rivera和他的團隊發(fā)現(xiàn)了一種與尤文氏肉瘤有關的蛋白。這種蛋白聚集在與腫瘤發(fā)生相關的基因組附近時可激活致癌基因表達，而異常的相分離就可能促使這種蛋白在這些區(qū)域附近聚集。
 

細胞保護作用

Hyman和Alberti發(fā)現(xiàn)酵母細胞在低pH的壓力環(huán)境下，一些重要蛋白會聚集成液滴啟動保護機制。當pH回升后，這些液滴會分散開，細胞恢復正常的功能。
 

相分離研究中使用的主要技術

研究相分離涉及的相關步驟及技術有很多，首先通常會用到體外重構相分離，通過將目標物質表達純化，在體外重構相分離的過程，證明存在相分離機制。其次，相分離研究的關鍵是要證明所研究的目標物質（蛋白、RNA等）存在動態(tài)可逆的聚集-解聚狀態(tài)變化，并且這一變化與目標物質的功能有關。因此如何證明這種動態(tài)變化狀態(tài)是關鍵。
 

這一過程包括觀察相分離的技術以及影響和調控相分離過程的技術，如：顯微成像技術、光調控系統(tǒng)（OptoDroplets、CasDrop）、溶液渾濁度檢測、離心沉淀法、表面張力測定（反毛細管速度+被動微流變學）、液滴內部硬度測定（原子力顯微鏡或光鑷）、聚合物網格孔徑測定（熒光標記右旋糖苷）等。
 

顯微成像作為觀察相分離的主要技術，在相分離中發(fā)揮著*的作用。按觀察方式主要涉及明場光學顯微鏡和熒光顯微鏡。明場顯微鏡中主要通過微分干涉（DIC）、相差（PH）、偏光（POL）等方法觀察體外、無標記的相分離溶液，可獲得液滴形成過程、大小及隨時間變化、液滴內部纖維性或固態(tài)樣結構各項異性等結果。對于體外和體內熒光標記的研究對象，則采用熒光顯微鏡去觀察并獲取高分辨的液滴形成過程、大小及隨時間變化的熒光圖像，以及分子擴散性和液滴內部分子擴散能力等研究。
 

明場顯微鏡

運用明場顯微鏡DIC或者PH的功能，可以獲得：

• 液-液相分離形成的液滴，得到形成時間、輪廓大小、融合或裂變擴散等信息；

• 隨著加入藥物處理，可觀察液滴大小變化、融合或者裂變擴散。

如圖4，在DIC明場顯微鏡模式下觀察隨時間變化，液滴形態(tài)大小的變化。

圖4. DIC明場顯微鏡觀察相分離隨時間的變化過程 
 

熒光顯微鏡

因其分辨率高，能夠清晰觀察靜態(tài)液滴輪廓邊界以及亞細胞的分子結構（如圖5），對于動態(tài)過程的采集，也能獲取更為清晰的圖像，是相分離成像的主要觀察手段。

圖5. 小鼠胚胎干細胞相分離免疫熒光圖像
 

圖6. HeLa細胞核中蛋白聚集、分離形成小液滴
 

激光共聚焦顯微鏡

除了上述檢測液滴輪廓、大小，融合裂變、分子結構、定位等實驗外，在激光掃描共聚焦顯微鏡上還可以進一步利用熒光漂白后恢復實驗（FRAP）檢測液滴中的擴散行為。FRAP實驗原理是使用高強度激光將對選定區(qū)域進行漂白，然后觀測該區(qū)域熒光強度隨時間恢復的動力學過程。FRAP是非常有效的研究分子動力學變化的技術手段，它可檢測體外和體內的相分離、可評估液滴內部的同質性，具備激光功率可控、靈活照明控制、靈活選擇漂白區(qū)域等*優(yōu)勢，在相分離研究中能發(fā)揮重要作用?；诠簿劢癸@微鏡的FRAP實驗除了可以獲取高分辨圖像，還能獲取動態(tài)的漂白恢復曲線信息（如圖7），更好地評估相分離中的動力學過程。

圖7. 基于激光共聚焦顯微鏡的FRAP實驗研究相分離
 

如需觀察更為微觀的納米結構，可以使用超高分辨共聚焦顯微鏡，實現(xiàn)50nm的解析精度，也可使用電子顯微鏡做進一步的結構分析。