共聚焦顯微鏡的分辨率受哪些因素影響

　　共聚焦顯微鏡，最常見的是共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)或激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)，是一種光學(xué)成像技術(shù)，可通過使用空間針孔來阻擋散焦光來提高顯微圖像的光學(xué)分辨率和對(duì)比度。在圖像形成中。捕獲樣品中不同深度的多個(gè)二維圖像可重建三維結(jié)構(gòu)(此過程稱為光學(xué)切片)。該技術(shù)廣泛用于科學(xué)和工業(yè)界，典型的應(yīng)用是生命科學(xué)、半導(dǎo)體檢查和材料科學(xué)。
 

　　共聚焦顯微鏡是一種掃描成像技術(shù)，通過與其他掃描技術(shù)(如掃描電子顯微鏡SEM)進(jìn)行比較，可以解釋所獲得的分辨率。CLSM的優(yōu)點(diǎn)是，例如在AFM或STM中，不需要將探針從表面上懸垂納米級(jí)，例如，通過在表面上用細(xì)小進(jìn)行掃描即可獲得圖像。從物鏡到表面的距離(稱為工作距離)通?？膳c常規(guī)光學(xué)顯微鏡相媲美。它隨系統(tǒng)光學(xué)設(shè)計(jì)的不同而變化，但是典型的工作距離是幾百微米到幾毫米。
 

　　在共聚焦顯微鏡CLSM中，樣品由點(diǎn)激光源照射，每個(gè)體積元素都與離散的散射或熒光強(qiáng)度相關(guān)。在此，掃描體積的大小由光學(xué)系統(tǒng)的光斑大小(接近衍射極限)決定，因?yàn)閽呙杓す獾膱D像不是無限小的點(diǎn)而是三維衍射圖案。此衍射圖樣的大小及其定義的焦點(diǎn)體積由數(shù)值孔徑控制系統(tǒng)的物鏡和所用激光的波長。這可以看作是使用廣角照明的傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的經(jīng)典分辨率極限。但是，通過共聚焦顯微鏡，甚至可以改善寬視場照明技術(shù)的分辨率極限，因?yàn)榭梢躁P(guān)閉共聚焦孔以消除更高階的衍射圖。例如，如果針孔直徑設(shè)置為1艾里單位那么只有一階衍射圖樣會(huì)通過孔徑到達(dá)檢測器，而更高的階數(shù)會(huì)被遮擋，從而以稍微降低亮度的代價(jià)提高了分辨率。在熒光觀察中，共聚焦顯微鏡的分辨率極限通常受信噪比限制由熒光顯微鏡中通?？捎玫纳倭抗庾右鸬??？梢酝ㄟ^使用更靈敏的光電探測器或通過增加照明激光點(diǎn)光源的強(qiáng)度來補(bǔ)償這種影響。增加照明激光的強(qiáng)度可能會(huì)對(duì)目標(biāo)樣品造成過度漂白或其他損壞，特別是對(duì)于需要比較熒光亮度的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)對(duì)屈光不同的組織(例如植物葉片的海綿狀葉肉或其他包含空氣的組織)進(jìn)行成像時(shí)，通常會(huì)損害共聚焦圖像質(zhì)量的球面像差。但是，通過將樣品安裝在光學(xué)透明，無毒的全氟化碳(如全氟萘烷)中，可以降低此類像差容易滲入組織，其折射率幾乎與水相同。