徠卡倒置顯微鏡平滑肌細胞劃痕愈合研究

可靠的長時間活細胞成像

本文主要討論如何使用專門配置的徠卡倒置顯微鏡和臺式細胞培養(yǎng)箱輕松、可靠地研究多孔板中培養(yǎng)的平滑肌細胞（SMC）的劃痕愈合情況。血管受損后影響SMC增殖和遷移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)情況在醫(yī)學研究中有重要意義。由于SMC遍布全身，所以對其遷移情況的研究也有助于癌癥和損傷的治療。

引言

研究人員主要研究血管損傷后及動脈粥樣硬化進展過程中控制SMC的增殖和遷移的機制和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)情況[1,2]。這些平滑肌細胞和脈管系統(tǒng)遍及全身各部位的每一種組織內(nèi)，包括但不限于肺部、腸道和大腦。已發(fā)表的研究報告已經(jīng)證實了SMC的增殖和遷移在癌癥、眼部損傷以及動脈粥樣硬化進展過程相關(guān)[1,2]。本文主要講述如何通過徠卡倒置顯微鏡和臺式細胞培養(yǎng)箱以更加有效、可靠的方式研究多孔板中培養(yǎng)的SMC相關(guān)的劃痕愈合情況。

挑戰(zhàn)

在融合的單層細胞形成劃痕時，須隨時監(jiān)測劃痕的再生和“愈合"情況，以測定其恢復(fù)能力[3]。這就需要一個可靠的成像解決方案，該解決方案應(yīng)能：1）讓細胞存活更長時間，及2）即使在多孔板內(nèi)成像，也可在成像過程中持續(xù)將焦點放在細胞上。

方法

在此研究中，多孔板內(nèi)貼壁培養(yǎng)的融合單層SMC生成“劃痕"。其是由p200移液器吸頭造成的。為研究劃痕愈合情況，緊接著使用物鏡為10x/0.32 NA（數(shù)值孔徑）的DMi8 倒置顯微鏡在相差模式下觀察細胞生長情況19個小時以上。使用了量子載物臺和臺式培養(yǎng)箱來培養(yǎng)細胞[4]。載物定位的可再現(xiàn)性功能確保在拍攝多個位置后不會丟失觀察位置。自適應(yīng)焦點控制（AFC）可使物鏡“鎖定"樣本從而保持焦點，因為AFC會主動檢查樣本和物鏡的距離，隨時且隨板孔的變化保持焦點。每20分鐘拍攝一次圖像，共有114個時間點。整個過程對3個孔中的劃痕區(qū)域進行了觀察。采集圖像后，使用Leica 2D分析軟件對其進行處理，計算隨著時間推移劃痕面積發(fā)生的變化。整個實驗包括對照共檢測了4個不同孔。

結(jié)果

圖1中，單個位置顯示為19小時采集的代表性時間序列，并顯示了典型的劃痕愈合進展情況。面積隨時間的變化分析結(jié)果如圖1的下半部分所示。圖2所示為繪制的4個孔中3個孔隨時間變化的曲線，說明劃痕愈合的進展情況，即單層細胞在劃痕中的再生。

圖1：劃痕愈合過程中的SMC圖像。A-E所示為位置1在A) 0小時、B) 4小時40分、C) 9小時20分、D) 14小時、E) 18小時40分時未處理圖像裁剪部分。A’-E’所示為計算劃痕愈合率時處理的相應(yīng)面積，其中黃線表示細胞與開放空間之間的邊界。比例尺為200 um。圖片由弗吉尼亞大學資深科學家Laura S. Shankman博士提供。

圖2：劃痕面積隨時間變化的曲線說明單層細胞隨著時間的推移的恢復(fù)情況。在3個單獨的孔中監(jiān)測劃痕恢復(fù)情況，并將此標記為位置1至3B。位置3A和3B處于同一孔中，但是同一劃痕的不同區(qū)域。

結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，使用專門配有量子載物臺、自適應(yīng)焦點控制（AFC）和臺式培養(yǎng)箱的DMi8 倒置顯微鏡，可輕松對多孔板中培養(yǎng)的SMC的劃痕愈合的過程進行研究。

參考文獻

1. L. Shankman, D. Gomez, O. Cherepanova, M. Salmon, G.F. Alencar, R.M. Haskins, P. Swiatlowska, A.A.C. Newman, E.S. Greene, A.C. Straub, B. Isakson, G.J. Randolph, G.K. Owens, KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis, Nat. Med. (2015) vol. 21, pp. 628–637, DOI: 10.1038/nm.3866.

2. O. Cherepanova, D. Gomez, L. Shankman, P. Swiatlowska, J. Williams, O.F. Sarmento, G.F. Alencar, D.L. Hess, M.H. Bevard, E.S. Greene, M. Murgai, S.D. Turner, Y.-J. Geng, S. Bekiranov, J.J. Connelly, A. Tomilin, G.K. Owens, Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective, Nat. Med. (2016) vol. 22, pp. 657–665, DOI: 10.1038/nm.4109.

3. K. Schwab, How can PAULA help streamline the workflow for my wound healing assay? Application for wound healing assays, Science Lab (2019) Leica Microsystems.

4. J. Neumann, A. Scherhag, S. Otten, F. Shen, A.L. Leifke, U. Birk, C. Greb, K. Lucas, C. Cremer, Chronic Inflammation Under the Microscope, Science Lab (2017) Leica Microsystems.