—— PROUCTS LIST
捕捉神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道
利用高分辨率顯微技術(shù)確定膜蛋白的位置
中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道位于神經(jīng)元突觸前后的膜室和突觸外膜室內(nèi)。這些蛋白質(zhì)的激活對突觸融合和調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放的影響取決于它們相對于突觸的精確位置，以及分子在細(xì)胞微隔室的密度大小和耦合效應(yīng)。因此，對膜約束受體和離子通道進(jìn)行高分辨率的定性與定量的可視化研究，對于理解它們在細(xì)胞通訊中發(fā)揮的作用至關(guān)重要。
神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的分子動力學(xué)
神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)能力和環(huán)境適應(yīng)能力表明，從動力學(xué)角度而言，神經(jīng)元具有改變其連接數(shù)量、類型和強度的基本能力。這些連接被稱為突觸，是突觸后神經(jīng)元和突觸前末梢之間高度有序的接點。特化的突觸膜包含大量分子，如受體、離子通道和相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白，其中精確的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)對其發(fā)揮正常功能具有促進(jìn)作用。大量研究表明，這些蛋白質(zhì)的位置和它們相對于突觸的位置都會對其功能作用產(chǎn)生實質(zhì)性影響。神經(jīng)遞質(zhì)受體位于神經(jīng)元突觸后區(qū)的突觸膜上，直接接觸釋放的神經(jīng)遞質(zhì)。
因此，受體瞬時激活，迅速產(chǎn)生突觸后反應(yīng)，與突觸前動作電位之間具有精確的鎖時關(guān)系。相反，位于突觸外質(zhì)膜上的受體，遠(yuǎn)離突觸點，被溢出的神經(jīng)遞質(zhì)激活，產(chǎn)生抑制性電導(dǎo)，該電導(dǎo)與單個突觸前動作電位之間并不存在精確的鎖時關(guān)系，而是以較慢的速度反映整體網(wǎng)絡(luò)活動[1]。受體也可位于突觸前，要么位于軸突末梢的突觸外膜上，要么位于突觸前網(wǎng)格上，由相同或相鄰的突觸扣結(jié)釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)所激活。與神經(jīng)遞質(zhì)受體一樣，離子通道也位于神經(jīng)元的樹突膜和軸突末梢上。突觸后通道通常在突觸輸入的融合與可塑性方面發(fā)揮作用，并通過介導(dǎo)緩慢的抑制性突觸反應(yīng)，增強靜息膜電位，來控制神經(jīng)元興奮。
集中于突觸前活性區(qū)或位于突觸扣結(jié)外膜的突觸前離子通道參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而在神經(jīng)元活動的突觸前調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。因此，很容易理解，同一受體和離子通道針對細(xì)胞的不同亞細(xì)胞區(qū)室時可以滿足不同的功能要求 [1]。
此外，膜蛋白激活對突觸融合與調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放所產(chǎn)生的影響，主要取決于受體和離子通道在靶神經(jīng)元區(qū)室的密度大小和功能耦合，膜蛋白激活對受體和離子通道相對于興奮性和抑制性突觸點所處位置的影響也是同理。因此，問題在于如何在高分辨率下精準(zhǔn)確定這些分子的亞細(xì)胞位置。
先進(jìn)的高分辨率免疫細(xì)胞化學(xué)方法
為此，下列先進(jìn)的高分辨率免疫細(xì)胞化學(xué)方法已得到廣泛應(yīng)用：
1
包埋前免疫膠體金法；
2
包埋后免疫膠體金法；
3
基于十二烷基硫酸鈉(SDS)的冷凍斷裂復(fù)型標(biāo)記(SDS-FRL)技術(shù)。
（1）在包埋前免疫膠體金法中，一個0.8nm或1.4nm的金顆粒與二抗發(fā)生耦合反應(yīng)，從而促進(jìn)適當(dāng)?shù)臐B透。隨后采用銀強化法，對金顆粒進(jìn)行強化，生成大小足以被檢測的顆粒。
由于這種方法生成了非擴散性標(biāo)記，因此可以確定發(fā)生反應(yīng)的精確位置以及蛋白質(zhì)在突觸外和突觸周圍所處的位置。然而，我們無法利用這種方法檢測突觸蛋白，原因可能在于固定組織的特化突觸結(jié)構(gòu)中的抗原表位難以確定[2]。
（2）包埋后免疫膠體金法解決了包埋前技術(shù)存在的問題。該方法使免疫化學(xué)品與暴露在超薄切片表面的抗原發(fā)生反應(yīng)，隨后采用與檢測非突觸分子相同的靈敏性檢測法來檢測突觸蛋白。這種方法還改善了蛋白質(zhì)密度的定量評估。
但是，在樹脂包埋切片中，大量蛋白質(zhì)掩藏，無法確定抗體，如此便限制了這種技術(shù)的檢測靈敏度[2]。
（3）在SDS-FRL技術(shù)中，我們先用高壓冷凍儀（徠卡EM ICE）對腦組織進(jìn)行冷凍，然后使用復(fù)型儀（徠卡EM ACE900）對冷凍樣本進(jìn)行冷凍斷裂。蛋白質(zhì)會被分配到質(zhì)膜的原生質(zhì)面（P面）或外質(zhì)面（E面）。將分子固定在薄碳層（3-5nm）上，再進(jìn)行2nm厚的鉑/碳層鍍膜，遮住膜面，然后用15-20nm厚的碳沉積物強化這種材料[3]。與傳統(tǒng)的免疫膠體金法相比，SDS-FRL技術(shù)有兩個主要優(yōu)勢。
首先，SDS-FRL技術(shù)的靈敏度大大高于包埋前和包埋后技術(shù)，因為膜蛋白暴露于復(fù)型品的二維表面（圖1），使其很容易接觸到免疫試劑。此外，SDS會使抗原表位發(fā)生變性，讓適合進(jìn)行免疫印跡解析的抗體與固定在復(fù)型膜上的蛋白質(zhì)發(fā)生相似反應(yīng)。其次，我們可以同時觀察到突觸蛋白質(zhì)和突觸外蛋白質(zhì)，并且可以在膜段中實現(xiàn)免疫膠體金密度的量化。
圖1：利用SDS冷凍斷裂復(fù)型標(biāo)記技術(shù)展示海馬細(xì)胞樹突中GABA（B1）和Kir3.2的分布和共定位分析。圖A：在一個假定錐體細(xì)胞的樹突軸（Den）和樹突棘（s）的表面上發(fā)現(xiàn)了GABA(B1)亞單位的免疫顆粒群（箭頭處）。圖B、C：Kir3.2（5nm顆粒；雙箭頭處）、GABA（B1）（10nm；箭頭處）和PSD-95（C中15nm）的雙重和三重免疫膠體金標(biāo)記顯示，這兩種蛋白質(zhì)在錐體細(xì)胞的樹突棘（B和C）中聚集，并與PSD-95（C）的免疫反應(yīng)所指的谷氨酸能突觸相關(guān)聯(lián)。比例尺:200 nm
與其他方法一樣，這種免疫細(xì)胞化學(xué)法也有一定局限性。首先，我們很難識別標(biāo)記的形態(tài)結(jié)構(gòu)，因此，有必要使用標(biāo)記蛋白，從而有助于識別經(jīng)過斷裂的膜[6]。其次，我們無法預(yù)測膜蛋白會分離到P面還是E面：有些蛋白優(yōu)先分到P面，如GABA（B1）、Kir3.2[4]，或分到E面，如AMPA受體[5]，而其他蛋白，如gluRδ2[6]，則同時定位于兩個面。因此，進(jìn)行定量研究應(yīng)仔細(xì)檢查分子的分配。
綜上所述，這三種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)提供了關(guān)于蛋白質(zhì)的細(xì)胞和亞細(xì)胞分布的補充信息，在高分辨率下對受體和離子通道在神經(jīng)元突觸前后區(qū)的定位和共定位問題進(jìn)行定性定量分析時，這些技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)
1. Farrant M, Nusser Z: Variations on an inhibitory theme: phasic and tonic activation of GABA(A) receptors. Nature Rev Neuroscience 6:3 (2005) 215–229.
2. Lujan R, Nusser Z, Roberts JDB, Shigemoto R, Somogyi P: Perisynaptic location of metabotropic glutamate receptors mGluR1 and mGluR5 on dendrites and dendritic spines in the rat hippocampus. Eur J Neuroscience 8:7 (1996) 1488–1500.
3. Fukazawa Y, Masugi-Tokita M, Tarusawa E, Hagiwara H, Shigemoto R: SDS-digested freezefracture replica labeling (SDS-FRL), in: Handbook of Cryo-preparation Methods for Electron microscopy, eds. Cavalier A, Spehner D, Humbel BM; CRC Press, New York (2009) 567–586.
4. Kulik A, Vida I, Fukazawa Y, Guetg N, Kasugai Y, Marker CL, Rigato F, Bettler B, Wickman K, Frotscher M, Shigemoto R. Compartment-dependent colocalization of Kir3.2-containing K+ channels and GABAB receptors in hippocampal pyramidal cells. J Neuroscience 26:16 (2006) 4289–4297.
5. Masugi-Tokita M, Tarusawa E, Watanabe M, Molnar E, Fujimoto K, Shigemoto R: Number and density of AMPA receptors in individual synapses in the rat cerebellum as revealed by SDS-digested freeze-fracture replica labeling. J Neuroscience 27:8 (2007a) 2135–2144.
6. Masugi-Tokita M, Shigemoto R: High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr opinion in Neurobiology 17 (2007b) 387–393.
7.Fujimoto K: Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Journal of Cell Science 108 (1995) 3443–3449.
